Scaffolds-3D de quitosana (CHI), fibroína (SF) e hidroxiapatita (HA) são biocompatíveis e atrativos para aplicações na engenharia tecidual óssea. Sendo assim, objetivou-se preparar, caracterizar e avaliar o comportamento in vitro de scaffolds-3D de CHI, CHI/SF, CHI/SF/HA. Os biomateriais foram produzidos a partir de uma solução de CHI, CHI/SF e CHI/SF/HA em ácido acético e após a realização dos processos de produção foram submetidos a testes in vitro com células SaOS-2 por 07, 14 e 21 dias. Os arcabouços foram caracterizados por difração de raios-X, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier com refletância total atenuada, análise termogravimétrica, calorimetria exploratória diferencial, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia de energia dispersiva, e submetidos a testes para verificação da porosidade, tamanho de poro e ângulo de contato. A viabilidade e a atividade celular foram avaliadas por redução de MTT e pela detecção da atividade de fosfatase alcalina. Os scaffolds-3D foram considerados atóxicos e capazes de promover adesão, proliferação e diferenciação celular, podendo ser utilizados na terapia do reparo de defeito ósseo.