Los andamios 3D de quitosana (CHI), fibroína (SF) e hidroxiapatita (HA) son biocompatibles y atractivos para aplicaciones en ingeniería de tejidos óseos. Por lo tanto, el objetivo fue preparar, caracterizar y evaluar el comportamiento in vitro de los andamios 3D de CHI, CHI/SF y CHI/SF/HA. Los biomateriales se produjeron a partir de una solución de CHI, CHI/SF y CHI/SF/HA en ácido acético y, tras los procesos de producción, se sometieron a pruebas in vitro con células SaOS-2 durante 7, 14 y 21 días. Los andamios se caracterizaron mediante difracción de rayos X, espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier con reflectancia total atenuada, análisis termogravimétrico, calorimetría diferencial exploratoria, microscopía electrónica de barrido, espectroscopia de energía dispersiva, y se sometieron a pruebas para verificar la porosidad, el tamaño de los poros y el ángulo de contacto. La viabilidad y la actividad celular se evaluaron mediante la reducción de MTT y la detección de la actividad de la fosfatasa alcalina. Los andamios 3D se consideraron no tóxicos y capaces de promover la adhesión, la proliferación y la diferenciación celular, por lo que pueden utilizarse en la terapia de reparación de defectos óseos.